Reto de laboratorio para la selección de camarones blancos resistentes a IMNV

La mionecrosis infecciosa puede causar pérdidas importantes

IMNV
Un menor de edad Litopenaeus vannamei Aparecen músculos opacos de la cola con mionecrosis infecciosa aguda.

Se detectó mionecrosis infecciosa (NMI) en granjas camaroneras brasileñas en 2003 en el camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei). El virus de la mionecrosis infecciosa viral (IMNV) recibió más tarde el nombre de la enfermedad que causó.

La infección de IMNV en las granjas afectadas puede causar un 40-60 por ciento de mortalidad y un daño económico significativo. Porque el IMNV se comporta de manera similar al virus del síndrome de Taura (TSV) en el sentido de que la enfermedad inducida por el virus suele causar supervivientes de los que se espera que tengan cierta resistencia a la infección por IMNV.

Por lo tanto, el laboratorio de los autores y otros han buscado desarrollar métodos de prueba de laboratorio similares a los desarrollados hace más de diez años para TSV resistentes L. vannamei.

Desarrollando un desafío temprano

Para permitir la comparación de la resistencia a IMNV con diferentes familias, fue necesario desarrollar un protocolo de prueba simple y estandarizado. Los factores considerados en el desarrollo del protocolo incluyeron el requisito de que el método genere más del 50% de mortalidad en una línea de base sensible a IMNV libre de patógenos específicos (SPF). L. vannamei y hacerlo simple y repetible. Para lograr esto, primero fue necesario determinar qué método de exposición sería confiable y dar resultados duraderos.

El método oral se probó por primera vez porque imita más de cerca la ruta natural de infección en los estanques, a través del canibalismo. Sin embargo, la mortalidad fue baja, los resultados de supervivencia fueron inconsistentes y la prevalencia de infecciones por IMNV diagnosticadas en camarones infectados fue baja incluso varias semanas después de la infección.

El desafío de la investigación de las inyecciones ha llevado a una mayor mortalidad y una mayor prevalencia de infecciones por IMNV. Por lo tanto, esta vía de desafío se examinó entre las seleccionadas para evaluar la resiliencia. L. vannamei para familias.

Prueba de estrés

Los primeros ensayos se realizaron con una prueba de esfuerzo de 30 a 50 días que consistía en una disminución repentina de la salinidad realizada de seis a siete días después de la administración de IMNV cuando al menos el 50 por ciento de la población desarrolló músculos de la cola opacos que sugerían una infección por IMNV. Las pruebas de esfuerzo no mostraron una mortalidad significativa asociada con la infección por IMNV. Los signos graves de NMI se desarrollaron con o sin carga adicional, aunque el estrés aumentó la prevalencia de los signos de NMI en dos días.

La exclusión de las pruebas de estrés del protocolo de muestra de IMNV proporcionó un mejor modelo de infección, ya que las muertes resultantes directamente de una disminución repentina de la salinidad ocurrieron tanto en los grupos de control infectados como en los no infectados. Los resultados de estudios experimentales adicionales también mostraron que las infecciones por IMNV solo pueden iniciarse durante 20 días sin diferencias significativas en la supervivencia de 20 a 50 días después de la infección.

Línea de camarones resistentes a IMNV

El uso de una reserva resistente a IMNV aparentemente ha sido un problema en el desarrollo de un método confiable de infección por IMNV. Todos los estudios de la Universidad de Arizona utilizaron la línea KF del stock de referencia SPF en el trabajo original. L. vannamei desarrollado por el Consorcio de Camarones Marinos de los Estados Unidos.

Irónicamente, la línea Kona muestra poca resistencia a patógenos virales como el TSV y el virus del síndrome de la mancha blanca. Sin embargo, numerosos desafíos de IMNV dan como resultado una supervivencia del 95 al 100 por ciento, y los camarones Kona extraídos de estos estudios muestran infecciones de IMNV variables pero generalmente de bajo grado. Los estudios orales o inyectables con este stock no han mostrado una mortalidad significativa, aunque los camarones están constantemente infectados con IMNV.

Solo otras lineas L. vannamei TSV e IMNV desafiaron a la universidad a comparar la serie de acciones en la industria seleccionada. Cuando las poblaciones seleccionadas por su resistencia al TSV y otros rasgos mostraron tasas de mortalidad variables, a menudo mucho más bajas que las encontradas en el mismo estudio que los controles de la línea Kona, se encontró que la línea Kona era resistente a la infección por IMN y / o IMNV. Además, estos hallazgos inesperados demostraron la utilidad del método de inyección en los estudios de infección por IMNV.

El desafío actual

La arquitectura actual del modelo de desafío IMNV es muy similar al modelo de desafío TSV desarrollado en 2002 en la Universidad de Arizona (UAZ). Brevemente, para el desafío de IMNV, la densidad máxima de 0.5 gramos / l se almacenó en la mayoría de los estudios y todos los contenedores contenían sus propios filtros biológicos. Cada tanque se mantuvo cubierto para contener aerosoles.

Los estudios de desafío de la resistencia a IMN realizados por UAZ varían en el número de líneas familiares evaluadas, con ensayos individuales que involucran hasta 13 líneas familiares. El protocolo estándar para cada desafío consistió en un número variable de tanques de muestra de IMNV, independientemente del tamaño del tanque, al menos un tanque de control negativo que contenía todas las familias infectadas con IMNV y un control positivo que consistía en una línea base de Kona. Cada fuente de prueba se ejecutó durante al menos 20 días después de determinar la tasa de supervivencia de cada línea familiar probada.

Las familias de camarones utilizadas en estos estudios fueron proporcionadas por empresas que participan en programas de selección de cepas resistentes al TSV. L. vannamei. La mayoría de los camarones infectados con UAZ han oscilado entre 1.0 y 3.0 gramos. Cuando se presentaron varias líneas familiares para el desafío IMNV, el proveedor marcó todas las familias con etiquetas de elastómero codificadas por colores antes del envío para facilitar su identificación.

En la mayoría de los experimentos, se incluye una línea de referencia Kona como control positivo para garantizar que el inóculo de IMNV utilizado para el experimento sea infeccioso. Aunque la línea Kona no sufre una alta mortalidad debido a la infección por IMNV, los camarones están constantemente infectados con IMNV y proporcionan un punto de referencia y una confirmación de que el inóculo es infeccioso.

La forma de probar

En los estudios de infección de UAZ, los cadáveres de camarones infectados con el aislado brasileño de IMNV se homogeneizaron mediante centrifugación antes de la clarificación. El líquido sobrenadante se recogió, se dispensó en tubos de 1 ml y se congeló a -80 ° C hasta su uso.

Al comienzo del estudio, se inyectaron aproximadamente 20 μl de homogeneizado de tejido clarificado diluido en solución salina estéril al 2% en el abdomen de cada camarón. Los camarones de control negativo recibieron el mismo volumen de solución salina estéril al 2%. Todos los camarones y camarones de control negativo expuestos a IMNV fueron alimentados una vez al día con una dieta comercial de mantenimiento de alimentos.

Mortalidad, supervivientes

Se observó una presentación del músculo de la cola blanca y opaca indicativa de infección por IMNV en camarones infectados con IMNV desde el día 6 del estudio. Las primeras muertes se registraron el día 10, después de lo cual se revisaron los tanques al menos dos veces al día durante el resto del estudio. Todos los animales muertos y muertos fueron retirados, identificados por familia o cruzados y registrados.

Los camarones muertos se congelaron a menos -80 ° C y, en algunos casos, la infección por IMNV se confirmó y cuantificó mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real utilizando camarones congelados recolectados muertos durante el estudio y muestras de los supervivientes al final. También se almacenaron en el fijador muestras de algunos animales muertos y supervivientes para confirmar mediante histología de rutina que la enfermedad fue causada por una infección por IMNV.

Al final del estudio, se identificaron y registraron las especies de animales supervivientes. Además, el examen histológico de los cinco camarones almacenados fijos antes del inicio del desafío documentó el estado de salud libre de IMNV de la población al llegar a la unidad de estudio.

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Figura 1:21 Supervivencia L. vannamei Familias desafiadas por el IMNV.

Resultados

Los resultados discutidos aquí se compilaron a partir de tres desafíos L. vannamei de tres granjas camaroneras en Hawaii. Un total de 21 L. vannamei Los linajes familiares fueron desafiados por el IMNV.

En general, la tasa de supervivencia para todas las líneas familiares evaluadas en 2009 fue del 7 al 54 por ciento. La supervivencia media de los controles positivos de la línea Kona fue del 95 por ciento, mientras que la supervivencia media de los controles negativos fue del 96 por ciento. En todos los estudios, la infección por IMNV se confirmó en camarones infectados.

El método de prueba de IMNV descrito se ha desarrollado aún más, pero ha prometido ser una herramienta útil para medir la resistencia de IMN en determinados L. vannamei. Las familias con una alta probabilidad de supervivencia podrían potencialmente usarse como masa de criadero para la producción de poslavados para poblaciones en áreas donde el IMNV es enzoótico, como se hizo anteriormente para la producción de poblaciones resistentes al TSV en áreas donde el TSN es enzoótico.

(Nota del editor: este artículo se publicó originalmente en la edición de julio / agosto de 2010 Defensor mundial de la acuicultura.)


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