Predicción de brotes de parásitos en granjas de peces a través del ADN ambiental

El estudio de caso de Barramundi muestra el potencial de una herramienta innovadora

La metodología para cuantificar el ADN de entornos patógenos proporciona a los gerentes de producción acuícola y a los profesionales de la salud una herramienta novedosa y eficaz para evaluar el riesgo de brotes de enfermedades. La imagen muestra al autor principal.

Las enfermedades tienen un impacto importante en el sector de la acuicultura y son una de las principales limitaciones para el crecimiento futuro. Se informa que las enfermedades causan alrededor del 40 por ciento de las pérdidas de producción acuícola ($ 102 mil millones). Por lo tanto, se necesitan enfoques innovadores para la detección temprana y el manejo de brotes de enfermedades en las granjas de acuicultura. El ADN ambiental (eDNA) es un método de muestreo que involucra métodos moleculares que permite la identificación de material genético de cualquier microorganismo o macroorganismo en el ambiente. Esta técnica puede cambiar la forma en que se detectan y monitorean los patógenos en la acuicultura.

El ADN ambiental es una alternativa al muestreo invasivo y la cuantificación de patógenos mediante la recolección de muestras de agua o suelo de los sistemas de acuicultura. Si bien los diagnósticos tradicionales (por ejemplo, histopatología, microbiología, PCR) siguen siendo métodos de oro estándar para confirmar patógenos animales infecciosos, estos métodos requieren mucho tiempo. Para cuando los agricultores reciban los resultados de las pruebas de diagnóstico tradicionales para controlar los brotes. El enfoque ambiental del ADN ofrece una oportunidad para mejorar el monitoreo de la salud animal mediante la detección de patógenos en los sistemas de acuicultura antes de que los animales se infecten.

De los diversos patógenos que afectan a la industria de la acuicultura, los protozoos en forma de anillo se consideran los parásitos más importantes económicamente de los peces. Los brotes de parásitos ciliares generalmente se desarrollan rápidamente, sin previo aviso, causando muertes muy rápidamente. Chilodonella hexasticha es un parásito anular común en el sistema de peces de agua dulce que puede matar a los peces en 2-3 días, alternando entre parásitos y etapas de vida libre. Utilizando C. hexasticha como organismo modelo, se probó una metodología de eDNA para la detección temprana y la cuantificación de patógenos en una granja de barramundi o gallineta nórdica asiática (Lates calcarifer).

Nota. Este artículo ha sido adaptado y resumido de la edición original (Acuicultura 479, 2017).

Estudio de caso de Barramundi: muestreo y procesamiento de laboratorio

Se recolectaron mensualmente durante un año muestras de agua de ocho estanques de arcilla (~ 1.4 ha) en una granja comercial de perca gigante de agua dulce en Australia. Se recogieron tres veces muestras de agua de estanque de 15 ml utilizando vasos de plástico individuales y se vertieron en tubos de centrífuga de 50 ml que contenían 1,5 ml de acetato de sodio (3 M) y 33,5 ml de etanol absoluto para conservar el ADN. Las muestras se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento en el laboratorio.

Las muestras se procesaron mediante precipitación y extracción directa de eDNA, y el material genético se extrajo mediante el protocolo de extracción CTAB. Se recolectaron células de parásitos similares de barramundi infectado durante el mismo período para identificar especies y confirmar el ensayo de PCR cuantitativa (qPCR). El ensayo QPCR se desarrolló para detectar la abundancia de C. hexasticha (copias de células / μl) en muestras de agua basadas en la región genética de las especies de SSU-rDNA. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de la recolección de muestras, desde la recolección de agua en la granja hasta el procesamiento de laboratorio molecular.

Figura 1: Diagrama de flujo (A a F) de estanques de agua dulce de barramundi (Lates calcarifer) (A) de la metodología de recolección de agua eDNA para análisis de qPCR (D, E, F) en el Laboratorio Molecular de la Universidad James Cook.

Además, los datos ambientales y biológicos de la granja (oxígeno disuelto, temperatura, precipitación, peso de los peces y mortalidad) se correlacionaron con el número de copias de células de C. hexasticha / el (eDNA) en el agua. Esta relación entre los parámetros de calidad del agua y la abundancia de parásitos se probó utilizando la temperatura máxima media del agua, el nivel mínimo de oxígeno disuelto y la precipitación para muestreos sucesivos de agua de 5 días en cada cuerpo de agua. De manera similar, la relación entre el número de parásitos en el agua y la mortalidad de los peces se evaluó utilizando el número promedio de peces muertos registrados en cada estanque después de muestrear el agua durante 5 días.

Los análisis se realizaron mediante regresión lineal y correlación para predecir la mortalidad de los peces observada dentro de los 5 días posteriores al muestreo de agua utilizando variables medidas (es decir, abundancia de C. hexasticha (eDNA), precipitación, oxígeno disuelto y temperatura del agua y peso de los peces) y se estimó si se han observada a partir de variables ambientales, se podría predecir la abundancia de C. hexasticha en muestras de agua. Además, la relación entre las variables observadas y el número de células parasitarias en el agua del estanque se utilizó mediante el análisis de componentes principales (PCA).

Resultados y discusión

En este estudio, se utilizó un método de e-DNA para cuantificar la abundancia del parásito de silicio C. hexasticha (eDNA) en el agua de una granja comercial de barramundi y su relación con la calidad del agua y los datos de producción. Se observó una asociación positiva en la abundancia de C. hexasticha en el agua del estanque (eDNA) y la mortalidad de los peces (círculo rojo; cuadrante I; Figura 2), que se relacionaron inversamente con el peso de los peces (cuadrante III; Figura 2) y los niveles de oxígeno disuelto (cuadrante IV; Figura 2). Esto también fue confirmado por la asociación positiva entre el número de parásitos en el agua del estanque (eDNA) y la mortalidad de los peces, pero se correlacionó negativamente con el tamaño de los peces. La mortalidad de los peces también se correlacionó fuerte y positivamente con el agua más cálida. En otras palabras, en la finca estudiada, los cuarteles más pequeños tendieron a verse particularmente afectados por altos niveles de parásitos de silia en el agua y la mortalidad durante las estaciones lluviosa y cálida.

Figura 2: Análisis de componentes principales (PCA) que muestra la relación: abundancia de C. hexasticha en el agua de la granja de barramundi (eDNA), mortalidad de los peces, peso de los peces, precipitación, oxígeno disuelto y temperatura promedio de los estanques muestreados en 2013/14. Las temperaturas medias del oxígeno disuelto y del agua se registraron cinco días antes de la recolección de eDNA. La mortalidad media de los peces se registró cinco días después de la recolección de eDNA.

Curiosamente, se observó una sincronicidad entre el recuento de células de C. hexasticha (eDNA) y la mortalidad de los peces observada cinco días después del muestreo (Figura 3). Las muestras de meses con mayor número de parásitos (eDNA) también fueron meses con mayor mortalidad de peces (Figura 3). Un alto número de células de C. hexasticha en el agua y el peso de los peces fueron predictores importantes de la mortalidad de los peces, mientras que la menor precipitación y el peso de los peces se asociaron significativamente con un alto número de células de C. hexasticha en el agua.

Se ha demostrado que el ADN ambiental es un enfoque poderoso que puede usarse para predecir la mortalidad de los peces, especialmente cuando se relaciona con los parámetros ambientales registrados en una granja. Dado que las piscifactorías suelen tener una grave mortalidad de peces no tratados, la cuantificación del ADN del parásito a partir de muestras de agua proporciona a los directores de producción y a los profesionales sanitarios una herramienta nueva y eficaz para evaluar el riesgo de futuros brotes.

Figura 3: Parámetros ambientales y biológicos de una granja de perca gigante de agua dulce de Australia recolectados durante 2013/14; C. abundancia de agua (eDNA) y mortalidad media de peces de C. hexasticha.

Aunque el enfoque del eDNA para monitorear los patógenos de la acuicultura es un área nueva de investigación, su potencial aún no se ha explorado comercialmente. Los enfoques de ADN ambiental se pueden utilizar como un método no invasivo para el muestreo de patógenos para reducir el estrés y mejorar el bienestar animal en las granjas de acuicultura.

Dado el conocimiento limitado de la diversidad de comunidades microbianas en los sistemas de acuicultura, eDNA es una nueva plataforma para que la industria desbloquee secretos submarinos. Específicamente, en el sector de la sanidad animal de la acuicultura, el eDNA brinda la oportunidad de comprender la abundancia de patógenos y las coinfecciones en los sistemas de cultivo. Con la próxima generación y las técnicas de secuenciación de alto rendimiento, se puede desarrollar una única prueba para detectar la presencia y abundancia de múltiples comunidades de agua en granjas y criaderos.

Por último, el eDNA se puede realizar fácilmente en una granja utilizando dispositivos portátiles e incorporarse a los programas de monitoreo de rutina como una herramienta eficaz para evaluar el riesgo de futuros brotes de enfermedades, lo que permite a los piscicultores implementar rápidamente estrategias de gestión preventiva de la salud y de intervención temprana.

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