Microsporidium Perezia sp. y la enfermedad del camarón del algodón

Detección por histopatología y nuevos métodos de hibridación in situ y PCR

En este estudio, se recolectaron muestras de camarones infectados con microsporidida, incluidos camarones tigre negro (Penaeus monodon), en Madagascar, Mozambique y el Reino de Arabia Saudita con signos clínicos de la enfermedad del camarón del algodón. Foto de Darryl Jory.

Los microsporidos son parásitos intracelulares obligatorios en muchos huéspedes, desde invertebrados hasta humanos. La investigación de microsporidos se ha centrado más en huéspedes terrestres, pero alrededor del 50 por ciento de las familias de microsporidos conocidas infectan huéspedes acuáticos como crustáceos y peces. Estas infecciones microsporídicas de huéspedes acuáticos se consideran un riesgo tanto para la salud como financiero en la acuicultura.

Una de las enfermedades críticas que afectan la acuicultura del camarón es la enfermedad del camarón algodonero (CSD) y los agentes causales asociados con esta enfermedad son los microsporidos que se encuentran en al menos cinco familias, incluidas Pleistophora, Thelohania, Perezia, Agmasoma y Ameson. Estos parásitos microsporidianos infectan principalmente el músculo esquelético, haciendo que las áreas afectadas del cuerpo sean blancas u opacas, lo que le da a la enfermedad su nombre común. Los camarones levemente infectados pueden verse y comportarse normalmente, pero las infecciones graves hacen que los camarones no sean comercializables o comestibles. En los camarones, la apariencia blanca opaca del músculo se asocia principalmente con infecciones microsporídicas. Sin embargo, otros agentes causales, como dinoflagelados, bacterias o virus, también pueden estar involucrados en esta enfermedad.

Este estudio se centró en microsporidios relacionados con la CSD en camarones recolectados en Madagascar, Mozambique y el Reino de Arabia Saudita. Examinamos sus propiedades histopatológicas y determinamos su clasificación taxonómica utilizando una secuencia de rDNA de subunidad pequeña (SSU rDNA). Estas secuencias se utilizan ampliamente para explicar las relaciones evolutivas entre organismos, ya que son de origen antiguo y se encuentran en todas las formas de vida conocidas.

También se han desarrollado métodos de diagnóstico específicos para esta enfermedad basados ​​en: 1. hibridación in situ [ISH; a type of hybridization using a labeled complementary DNA, RNA or modified nucleic acids strand (i.e., probe) to localize a specific DNA or RNA sequence in a portion or section of tissue]; y 2. reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método ampliamente utilizado en biología molecular para hacer múltiples copias de un segmento de ADN particular) que se dirige a una secuencia de ADNr de SSU.

Configuración de estudio

Un total de 298 muestras de camarones con signos clínicos de CSD se enviaron al Laboratorio de Patología Acuícola de la Universidad de Arizona de Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita. La Tabla 1 resume la información relevante.

Han, CSD, Tabla 1

País y especie Etapa de vida Grado Pos. Órgano diana / número total de muestras PCR

Madagascar (P. monodon) Adultos G3-G4 Músculos 3/3 N / A
Madagascar (P. monodon) Un menor de edad G3-G4 Músculo / HP 30/6 N / A
Madagascar (P. monodon) Un menor de edad N / A Músculo / HP N / A pos.
Madagascar (P. monodon) Un menor de edad G3-G4 Músculo / HP 19/4 N / A
Madagascar (P. monodon) Adultos G2-G3 Músculo / HP / corazón 3/5 N / A
Madagascar (P. monodon) Un menor de edad G1-G3 Músculo / HP 28/6 N / A
Madagascar (P. monodon) Un menor de edad N / A Músculos N / A pos.
Madagascar (P. monodon) Un menor de edad G3-G4 Músculo / HP 35/35 N / A
Madagascar (P. monodon) Un menor de edad N / A Músculo / HP N / A pos.
Mozambique (P. monodon) Un menor de edad G3-G4 Músculo / HP / Branquias / Corazón / LO 23/4 N / A
Mozambique (P. monodon) PL G3-G4 Músculo / HP / Branquias / Corazón / LO 2/50 N / A
Mozambique (P. monodon) Adultos G3-G4 Músculo / HP / Branquias / Corazón / LO 4/4 N / A
Arabia Saudita (P. indicus) Adultos G4 Músculo / HP / Branquias / Corazón / LO 3/3 N / A
Arabia Saudita (P. indicus) Adultos G2-G4 Músculo / HP 30/93 N / A
Arabia Saudita (P. indicus) Adultos N / A Músculos N / A pos.
Arabia Saudita (P. indicus) Un menor de edad G2-G4 Músculo / HP 5/5 N / A

Tabla 1. Muestras de la enfermedad del camarón algodonero utilizadas en este estudio (modificado de la tabla original). Las muestras se analizaron mediante examen histopatológico (para detectar la presencia de microspóridos) y pruebas de PCR. El sistema G-Class varía de G0 (negativo) a G4 (mayor gravedad). La columna de PCR muestra el órgano diana positivo para Perezia sp. (HP: hepatopáncreas; LO: órgano linfoide). PL: postlarvas; pos.: positivo; na: no disponible.

Se procesaron muestras fijadas de alcohol-formalina-ácido acético (AFA) de Davidson, se incluyeron en parafina y se cortaron (4 μm de espesor) de acuerdo con métodos estándar (Lightner, 1996). Después de teñir con hematoxilina y eosina (H&E) o Giemsa, las secciones se analizaron mediante microscopía óptica y se evaluó la gravedad de la infección de acuerdo con un sistema de clasificación G desarrollado previamente (Lightner, 1996). La clasificación incluye (G0) que no muestran evidencia de infección / infección por patógenos; (G1) existen signos de infección / infección por patógenos, pero a un nivel inferior al requerido para la enfermedad clínica; (G2 – G3) signos de infección moderados a altos y / o infección de acuerdo con el número y la gravedad del daño patógeno; y (G4) daño severo y destrucción de tejidos avanzados con un alto número de patógenos.

Resultados y discusión

Examen histopatológico

En camarones y otros crustáceos, Perezia spp. destruye los músculos y los reemplaza gradualmente a través de las etapas de desarrollo de los parásitos y las masas de esporas. En las últimas etapas de la infección, los parásitos pueden invadir otros tejidos y órganos, como los cardiomiocitos, el epitelio glandular aéreo y las células del tejido conectivo, en el mismo camarón. En este estudio, este microsporidio afectó a varios tejidos del mismo camarón. El examen histopatológico reveló numerosas esporas de microsporides en muestras recolectadas de Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita. La infección afectó principalmente al hepatopáncreas y los músculos en los grados de gravedad G1 a G4.

Se observaron esporas maduras en las fibras del músculo esquelético (Figuras 1A, B) y en etapas precargadas, y esporas en el epitelio de los túbulos hepatopancreáticos infectados (Figura 1C, D). En infecciones graves, también se observaron esporas en células epiteliales de filamentos glandulares (Figuras 1E, F), fibras miocárdicas (Figura 1G) y células parenquimatosas linfoides (Figura 1H). Las esporas que se diseminan por todo el cuerpo en una etapa posterior de la infección pueden deberse a una infección muscular: los músculos se deterioraron gradualmente y las esporas contaminaron los tejidos circundantes. Además, en la mayoría de los casos (90 por ciento) de las infecciones por CSD se asociaron con enfermedades infecciosas causadas por Zoothamnium sp. o Epistylis sp., que indicó que es probable que los animales con microsporidiosis sean débiles y susceptibles a infecciones secundarias.

Figura 1: Enfermedades características de la enfermedad causada por microsporides que se encuentran en camarones Penaeid de Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita. (A, B) Esporas maduras acumuladas entre las fibras del músculo esquelético; (C, D) esporas (flechas) y estadios de esporas (puntas de flecha) en células epiteliales tubulares hepatopáncreas (células marcadas hacia adentro); (E, F) acumulación intracitoplasmática de esporas maduras en células epiteliales endoteliales; (G) esporas maduras en fibras miocárdicas; (H) Células parenquimatosas de túbulos de órganos linfoides. Tinción: (A, C, E, G, H) hematoxilina / eosina floxina de Mayer-Bennett; (D, C, F) Giemsa. Barras de escala = 30 µm.

La secuencia de ADNr de SSD del nuevo microsporidio que causa la CSD

Realizamos las secuencias de rDNA SSU de camarones CSD recolectados en Madagascar por PCR y obtuvimos y secuenciamos el fragmento de 1.2 kpb. La secuencia de nucleótidos del rDNA de SSU se depositó en Genbank. Según los resultados de la prueba, la secuencia de nucleótidos era 94 por ciento idéntica a Pleistophora sp. infectando Penaeus setiferus y 93 por ciento idéntico al micro-sporidium no detectado de Metapenaeus joiner. En 2002, Pleistophora sp. El origen de P. setiferus fue re-identificado por estudios morfológicos como Perezia nelson. Con base en la información de la secuencia, ahora consideramos que el microsporidio recientemente identificado pertenece al género Perezia y lo llamamos Perezia sp. en adelante. Perezia sp. La CSD causada parece estar muy extendida en varias granjas camaroneras, incluidas Madagascar, Mozambique, Arabia Saudita (presente estudio), Estados Unidos y Japón, pero no se ha estudiado adecuadamente.

En este estudio, el ADN genómico aislado de muestras de Madagascar y Arabia Saudita se realizó mediante PCR utilizando cebadores específicos dirigidos al ADNr de SSU. Las secuencias resultantes fueron 100% idénticas para ambas muestras. Casualmente, el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) detectado en estos tres países (Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita) mostró patrones genómicos idénticos.

Perezia sp. – ISH específico

La sonda respondió fuertemente tanto al músculo esquelético como al hepatopáncreas (Figuras 2A-C), así como a otros órganos como branquias, corazón y órgano linfoide (datos no mostrados), de acuerdo con los hallazgos histopatológicos. Perezia sp. La sonda generada a partir de la secuencia de ADNr de SSU parece ser específica para camarones con síntomas de CSD de Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita.

Inicialmente, identificamos a Perezia sp. infección como una infección por EHP por examen histopatológico normal. Sin embargo, esta sonda ISH no respondió a P. Stylostris infectados por E. hepatopenaei (Figura 2D). No se observó reacción en tejidos preparados a partir de P. vannamei libre de patógenos. P. vannamei y P. monodon, así como policadas infectadas con microsporidium similares a Agmasoma no identificadas, tampoco respondieron a las sondas ISH (datos no mostrados).

Figura 2: Ensayo de hibridación in situ (ISH) con una sonda genética marcada con digoxígeno específica para la detección de microsporitis que causa la enfermedad del camarón del algodón. El precipitado azul oscuro indica la presencia del parásito (A) en las células epiteliales de los túbulos hepatopanciales de Penaeus indicus de Arabia Saudita (B) fibras de músculo esquelético de P. monodon de Mozambique y (C)

En células epiteliales del hepatopáncreas tubular de P. monodoni de Madagascar. D) Parte del hepatopáncreas de Brunei P. stylirostris infectada con enterocitozona hepatopena con resultados representativos, enfatizando la especificidad de la sonda como lo indica la ausencia de un precipitado azul oscuro. Mancha: contraparte Bismark-Brown. Barras de escala = 30 μm

Perezia sp. – PCR específica

Para fines de diagnóstico, diseñamos un par de cebadores de PCR dirigidos a Perezia sp. ADN y generó un amplicón de 443 pb (un término de biología molecular para denotar una pieza de ADN o ARN que es la fuente y / o producto de eventos de amplificación o replicación) que se muestra en la Figura 3. Esta reacción de PCR es específica para microsporidium Perezia sp. que causa CSD y por lo tanto puede ser útil para monitorear este parásito. Estos cebadores no reaccionaron con el ADN microsporídico de camarones infectados con E. hepatopenae (datos no mostrados). Tampoco hubo reactividad cruzada entre camarones (P. vannamei, P. monodon, P. indicus, P. stylirostris y Macrobrachium rosenbergii), policitos, calamares y Artemia spp. (datos no mostrados).

No analizamos muestras de Mozambique mediante PCR, pero la sonda reaccionó intensamente a la ISH depositando los productos de reacción en las células diana de las muestras de Mozambique. En este estudio, describimos los microsporidos infecciosos musculares y hepatopancreáticos que causan la CSD en camarones de Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita en el Mar Rojo y el Océano Índico.

Figura 3: Perezia sp. Resultados de PCR específica. Carriles 1-2: hepatopáncreas de Penaeus monodon de Madagascar; Carriles 3-6: músculo P. monodon de Madagascar; Carriles 7-8: músculo P. indicus de Arabia Saudita; Carril 9: enterocitosis hepatopenea (EHP); Carril 10: control libre de patógenos específicos (SPF); Carril 11: Control negativo (NC).

Perspectivas

Las infecciones de microsporitas se confirmaron mediante análisis histopatológico y Perezia sp. También desarrollamos pruebas ISH y PCR para detectar el parásito. Estos métodos pueden ayudar a los productores de camarón a controlar el microorganismo Perezia sp. Causado en el diagnóstico y manejo de CSD.

Referencias disponibles del primer autor.

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