Las pruebas de PCR de una sola muestra de tejido pueden dar datos engañosos

Un estudio australiano analiza la infección por virus asociados a infecciones (GAV) en camarones

El autor principal Tansyn Noble y Quyen Q. Banh, que extrajeron camarones de tejido infeccioso.

La mayor amenaza para la viabilidad y expansión del cultivo mundial de camarón es una enfermedad que se estima que causa más de $ 3 mil millones en pérdidas de producción anuales. Por lo tanto, el manejo adecuado de las enfermedades es crucial para minimizar estas pérdidas. Actualmente, el principal método de gestión del riesgo de enfermedades implica el uso de líneas de mejoramiento específicas libres de patógenos (SPF) o resistentes / tolerantes (SPR / T) para la producción de semillas de alta salud con fuerte bioseguridad y saneamiento.

Estas estrategias dependen en gran medida del acceso a métodos de detección de patógenos precisos, rápidos y sensibles, como las pruebas de PCR cuantitativa (qPCR) convencionales y en tiempo real, y se han desarrollado muchas pruebas de PCR para detectar todos los principales patógenos del camarón. En los casos en que se requieran pruebas no destructivas, como para el virus del camarón y la carga infecciosa, las únicas fuentes prácticas de tejido para las pruebas son muestras de branquias, pleópodos o hemolimas.

Se tomaron muestras de pleópodos para la detección de GAV.

El virus asociado a las branquias (GAV), también conocido como genotipo 2 del virus de la cabeza amarilla (YHV2), está muy extendido en los langostinos tigre negro (Penaeus monodon) silvestres y cultivados en Australia. En Australia, existe un interés creciente en establecer poblaciones reproductoras de P. monodoni que sean SPF y / o GAV SPR / T. Ambos requieren una identificación y cuantificación precisas de las cargas de infección de GAV, y el tejido glandular o pleopódico se usa comúnmente para RT-PCR análisis. Sin embargo, generalmente no se especifica en qué medida las cargas de GAV pueden diferir de diferentes fibras infecciosas o pleópodos extraídos del mismo camarón.

Este artículo resume un Estudio que utilizó ensayos de RT-qPCR para cuantificar con precisión las cargas de infección de GAV en diferentes criterios de valoración y pleópodos de P. monodon individual con infecciones adquiridas de forma natural para comparar la sensibilidad y variabilidad de cada tipo de tejido. Por supuesto, usamos animales infectados para comprender cómo el GAV puede variar en situaciones en las que ocurren infecciones naturales en lugar de artificiales, como la detección de camarones de granja o criaderos capturados en la naturaleza. También tomamos muestras de un subconjunto de P. monodon adulto de ambos lóbulos linfoides para comparar la sensibilidad de la detección de GAV en tejido branquial y pleópodo en comparación con el órgano linfoide, que es el tejido diana recomendado para GAV.

El autor principal fue apoyado por una subvención del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia y financiado por el Programa de Investigación de Transformación Industrial del Consejo de Investigación IH130200013.

Configuración de estudio

Tomamos tejidos de dos grupos independientes de P. monodoni que habían crecido en el Centro de Investigación de Bribie Island (BIRC) en Queensland, Australia. El grupo 1 constaba de 10 juveniles (peso medio 10,9 ± 1,4 gramos) y ambos camarones tenían muestras de ocho redes de enmalle y ocho pleópodos. El grupo 2 estaba formado por 12 camarones adultos (peso medio 40,4 ± 2,3 gramos) y cada camarón tenía una muestra de 10 filamentos, 10 pleópodos y ambos lóbulos linfoides. Los tejidos se almacenaron hasta su procesamiento.

Para obtener descripciones detalladas de la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y los procedimientos de qPCR en tiempo real; y análisis estadísticos, consulte la publicación original o el primer autor.

El coeficiente de variación (CV) se utilizó para determinar si el tejido de las branquias o pleópodos difería del nivel de variabilidad en las cargas de infección GAV detectadas entre los filamentos glandulares y pleópodos de muestras tomadas de cada camarón.

Resultados y discusión

El tratamiento de diversas enfermedades que afectan al camarón de cultivo depende de métodos fiables y precisos para detectar y cuantificar las infecciones por patógenos. En nuestro estudio, se utilizaron métodos de RT-qPCR para cuantificar y comparar las cargas de infección de GAV en los lóbulos de criterios de valoración individuales, pleópodos y órganos linfoides extraídos de langostinos tigre negros infectados con GAV.

La precisión de las réplicas técnicas fue generalmente alta, con la excepción de algunas cuyas muestras tenían una carga de infección de GAV muy baja y valores de desviación estándar más variables. La disminución de la precisión puede afectar la precisión de la detección y cuantificación de la infección por GAV, y se espera que el número de plantillas de ARN de GAV se acerque al límite de detección del ensayo RT-qPCR en cada reacción.

La carga de infección por GAV detectada a partir de filamentos individuales y / o pleópodos muestreados de cada camarón a menudo varió más de 10 veces y en algunos camarones hasta aproximadamente 3000 veces. La escala de variabilidad fue evidente en ambos grupos de P. monodon, independientemente de la gravedad de la infección por GAV. Se ha observado una variabilidad similar en la carga de infección, incluidos falsos negativos, en muestras de camarón blanco del Pacífico (Penaeus vannamei) infectadas con el virus del síndrome de la mancha blanca de bajo nivel (WSSV) y también pueden estar presentes con otros patógenos del camarón.

Nuestros resultados destacan la posibilidad de que se omitan las infecciones por patógenos cuando se utilizan muestras de tejido único, especialmente en camarones con pocas infecciones naturales. Es difícil predecir el número mínimo de muestras de filamentos infecciosos o pleópodos requeridos, pero en base a los juveniles de camarones ejemplificados en este estudio, el número mínimo de muestras de filamentos infecciosos o pleópodos requeridos para una prevalencia del 100% fue de cinco y siete, respectivamente. En camarones adultos, una muestra de tejido habría sido suficiente si todas las muestras fueran positivas, enfatizando la especificidad del tamaño mínimo de muestra para los grupos analizados.

Muestras tomadas para detectar GAV en el tejido final.

Un diagnóstico erróneo de infección puede tener graves consecuencias para los programas de cría de langostino tigre, en los que las familias silvestres suelen seleccionarse para la cría en función de sus pruebas de PCR negativas para patógenos específicos (libres de patógenos específicos o SPF). Nuestros datos indican que la prueba de un filamento de un solo extremo o pleópodo puede aumentar el riesgo de infección falsa negativa y no detectada, lo que resulta en la transmisión vertical del patógeno al árbol de semillas y luego a las farmacias u otras familias de SPF.

Puede ser más apropiado para la familia realizar varias pruebas de PCR consecutivas, preferiblemente usando conjuntos de más de una muestra de tejido, durante la cuarentena de las razas silvestres antes de su selección para su uso en programas de reproducción SPF. O, alternativamente, aumentar el número de camarones analizados para aumentar la precisión de las estimaciones de prevalencia en la detección a nivel de población.

La alta variabilidad en las cargas de infección de GAV en algunos camarones entre criterios de valoración individuales o pleópodos, además de posibles hallazgos falsos negativos, puede proporcionar datos de carga de infección inexactos y puede minimizar la gravedad de la infección al tomar muestras de un filamento glandular o pleópodo. Esto puede afectar la precisión de las comparaciones relativas de camarones individuales, ya que sin datos precisos sobre la carga infecciosa de patógenos individuales, la capacidad de predecir la contribución genética de la confianza entre individuos o miembros de la familia se ve gravemente afectada.

La carga de infección por GAV cuantificada en cada lóbulo de órgano linfoide del camarón adulto del grupo 2 fue claramente mayor (435-856 veces) y varió mucho menos que las cargas detectadas con pleópodos o filamentos terminales del mismo camarón, de acuerdo con análisis previos de P .monodon infectado con GAV. que encontró niveles más altos de GAV en el órgano linfoide.

Aunque el órgano linfoide es la muestra de tejido óptima para la detección de GAV, hay casos en los que el muestreo de este órgano no es apropiado porque requiere el sacrificio de animales (generalmente no es posible para la reproducción del camarón), el muestreo es difícil para los animales pequeños y la detección de alto rendimiento puede cansado de encontrar y diseccionar. Por lo tanto, a menudo se usan tejidos alternativos como la infección y los pleópodos, ya que se pueden muestrear de manera no destructiva y eficiente en la mayoría de los escenarios.

Por lo tanto, nuestros datos indican que ninguno de los tejidos es más favorable para obtener datos precisos sobre la carga de infección de GAV, por lo que la decisión sobre qué tipo de tejido (pleópodo o extremo) muestrear depende de cuál es el más apropiado para los procedimientos de recolección y laboratorio. Puede haber diferencias en la cantidad de ARN total aislado por microgramo de tejido y afectar las comparaciones relativas entre los tipos de tejido.

Perspectivas

Los resultados de nuestro estudio de camarones con infecciones GAV adquiridas naturalmente mostraron que las cargas de infección pueden diferir de diferentes branquias y filopopodos en el mismo camarón. En consecuencia, analizar una sola muestra de estos tejidos puede subestimar la gravedad de la infección o incluso conducir a un diagnóstico erróneo del animal infectado.

Si no es posible obtener muestras de linfoides, se recomienda analizar los grupos de tejidos de dos o más criterios de valoración / pleopidios para evitar esta variabilidad y obtener datos más precisos sobre la incidencia y la gravedad de la infección por GAV.

Referencias disponibles del primer autor.

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