La técnica de fijación húmeda es ideal para monitorear la salud, no para diagnosticar NHP en camarones

La histopatología, sondas genéticas, microscopía electrónica y PCR son otras técnicas

El brote de NHP ha resultado en camarones de muy diferentes tamaños
durante la cosecha.

En el camarón, el hepatopáncreas es un órgano vital para la producción de enzimas digestivas, la asimilación y almacenamiento de productos digestivos, el suministro de nutrientes para eliminar los metabolitos de hemolinfa residuales, el mantenimiento del equilibrio salino y la desintoxicación de metales pesados ​​y materia orgánica extraña. .

La bacteria de la hepatopancreatitis necrotizante (NHPB) es un patógeno que se encuentra principalmente en las células epiteliales tubulares del hepatopáncreas, donde causa atrofia y disfunción. En los animales infectados, la digestión, el almacenamiento de lípidos, el crecimiento saludable y el desarrollo de los camarones se ven afectados.

NHPB afecta a camarones menores y adultos debido a la ingestión o canibalismo de material infectado. Los signos clínicos de los camarones con hepatopancreatitis necrotizante incluyen conchas blandas y sueltas, cuerpo suelto y branquias oscuras. Los animales se vuelven letárgicos y anoréxicos. Los estanques afectados registran un crecimiento lento, tamaño heterogéneo en el momento de la cosecha, consumo reducido de alimento, baja viabilidad y conversión de alimento deficiente, lo que lleva a pérdidas económicas y de producción severas.

Identificación de la NHPB

Se cree que el NHP está asociado con la temperatura y la salinidad elevadas del agua, en base a un brote en el estado de Texas en los EE. UU. Luego de un aumento de temperatura por encima de 29 ° C y una salinidad de 20 a 40 ppt. Estas mismas condiciones ambientales ocurren durante todo el año en las granjas camaroneras del noreste de Brasil, donde también se han reportado serios brotes de NHP. De acuerdo con la experiencia de los autores, la presencia de NHP en sistemas de estanques semi-intensivos también está fuertemente relacionada con un manejo deficiente del fondo del estanque.

La NHPB es una bacteria intracelular rickettsial, pleomórfica, gramnegativa que pertenece al grupo de las α-proteobacterias que no pueden cultivarse mediante métodos microbiológicos tradicionales. Los administradores e investigadores de las granjas todavía están debatiendo la forma más efectiva de diagnosticar esta infección en el lugar.

Se dice que varios métodos son útiles para la detección de NHP, incluido el análisis de fijación en húmedo, histopatología, sondas de genes, microscopía electrónica y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Entre ellos, el análisis en húmedo ha sido el enfoque más utilizado en el campo, no solo para los programas de monitoreo de la salud, sino también para los diagnósticos esperados. Ha sido una práctica común en el cultivo de camarón brasileño confiar en el diagnóstico de NHP en estanques y luego en el uso de tratamientos terapéuticos solo en observaciones de superficie húmeda.

Comparación de métodos de prueba

En el estudio, los autores compararon técnicas de microscopía húmeda, histopatología y PCR para diagnosticar NHP en condiciones de campo. Litopenaeus vannamei y evaluó la utilidad de la técnica de fijación húmeda para el diagnóstico de esta enfermedad como método al aire libre.

Se pesaron camarones que pesaban entre 10 y 11 g con una red lanzada al azar de tres estanques de cultivo en un establecimiento comercial semi-intensivo donde se alegó la mortalidad inducida por NHP en Rio Grande do Norte, Brasil. Cada enfermedad del hígado del camarón se dividió en tres partes. Una pieza se utilizó para la fijación en húmedo y las otras dos se fijaron para histopatología posterior y análisis de PCR.

Para analizar la fijación húmeda, se colocó una porción de cada hepatopáncreas de camarón en un perfil de vidrio con solución salina al 3% y se observó bajo un microscopio. Cada muestra se clasificó por células abiertas del epitelio tubular, melanización y cambios en el color normal del líquido (naranja a marrón).

Los cambios tubulares y el contenido de lípidos se clasificaron entre 0 (normal) y 4 (fuertemente alterado) y 0 (libre de lípidos) a 4 (lleno de lípidos), respectivamente, los cuales estuvieron directamente relacionados con el estado nutricional del camarón. Las puntuaciones se distribuyeron según la gravedad de los cambios tubulares según la magnitud de los cambios en el campo por animal y la cantidad de lípidos según el porcentaje de tubos llenos de gotitas de aceite por campo y animal.

Para los análisis histopatológicos, las muestras se incluyeron en parafina y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina. Cada muestra se clasificó de acuerdo con la presencia clara de infiltración hemocítica, edema, lesiones granulomatosas y atrofia tubular.

Para la detección del ADN del agente causal en camarones hospedadores, se usó PCR como control en este experimento para detectar camarones portadores de NHP. Los ensayos de PCR se realizaron de acuerdo con un protocolo comercial conocido.

En este aumento de la fijación húmeda, los túbulos hepatopancreáticos muestran una puntuación de cambio de 4 y la ausencia de gotitas de lípidos.

Resultados

Para 154 muestras de hepatopáncreas de camarón, el 41.6 por ciento dio positivo en la prueba de PCR y el 58.4 por ciento en la prueba de PCR negativa para NHPB. Los animales infectados tenían niveles de lípidos más bajos y mayores cambios tubulares, células abiertas y melanización que los registrados como PCR-negativos. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas.

Se observó que el 25% de las muestras infectadas con NHP presentaban túbulos hepatopancreáticos perfectos (puntuación 0), mientras que el 21,9% presentaba cambios severos (puntuación 4). Aunque el porcentaje de individuos con túbulos normales fue mayor en el grupo de PCR negativo (36,7 por ciento), el 42,2 por ciento de los sujetos tuvo una incidencia moderada, alta o muy alta de cambios severos (Figura 1). De manera similar a los cambios tubulares, no se observó una asociación clara entre los niveles de lípidos hepatopancreáticos y los resultados de la PCR (Figura 2).

Figura 1: Relación entre muestras infectadas con NHP (PCR +) y no infectadas (PCR−) y cambios tubulares en el hepatopáncreas de camarón blanco del Pacífico. Figura 2: Relación de muestras infectadas con NHP (PCR +) y no infectadas (PCR−) a lípidos en el hepatopáncreas de camarón blanco en el Pacífico.

Los análisis histológicos mostraron que tanto los camarones infectados como los no infectados mostraron menor incidencia de infiltración hemocítica, edema y necrosis, y atrofia en el epitelio tubular, con lesiones granulomatosas (Cuadro 1). Las propiedades hepatopancreáticas o los criterios de diagnóstico observados para los enfoques tradicionales mejor asociados con los resultados positivos de la PCR fueron el contenido de lípidos (fijación húmeda) y la infiltración hemocítica (histopatología). Sin embargo, en este estudio, se encontró una correlación pobre (R = 0.07) entre los resultados de la PCR y los parámetros observados sobre una base húmeda o en histopatología, lo que indica que ninguno de estos métodos tradicionales puede usarse para diagnosticar NHP solo.

Gomes, porcentaje medio de lesiones histopatológicas observadas, tabla 1

Infiltración hemocítica (%) Infiltración hemocítica (%) Edema (%) Daño granulomatoso (%) Atrofia tubular (%)

PCR + (64) 93,8 ± 24,4 54,7 ± 50,2 18,8 ± 39,3 51,6 ± 50,4
PCR (90) 81,1 ± 39,4 57,8 ± 49,7 10,0 ± 30,2 52,2 ± 50,2

Cuadro 1. Porcentajes medios de lesiones histopatológicas observadas en el hepatopáncreas de camarón blanco del Pacífico observadas en NHP infectado (PCR +) y no infectado (PCR−). Los valores no difieren significativamente.

Perspectivas

Este trabajo mostró que el uso de la técnica de fijación húmeda por sí sola es inexacto en el diagnóstico de NHP, ya que ninguna de las lesiones observadas parecía ser específica de la enfermedad, y mucho menos la interpretación y clasificación subjetiva del examinador. Las técnicas de fijación en húmedo deben considerarse una prioridad para los productores de camarón con el fin de verificar periódicamente el estado general de salud y nutrición de sus poblaciones. Sin embargo, solo se deben considerar los métodos de PCR para confirmar la presencia de NHP.

De hecho, los túbulos hepatopáncreáticos de los camarones sanos suelen mostrar formas perfectas en forma de dedos llenas de gotas de aceite, lo que es un indicador de una buena nutrición y salud general y es evidente en los exámenes fijados en húmedo. Los cambios tubulares, la melanización y el bajo contenido de lípidos en el tejido hepatopancreático de los camarones pueden estar relacionados con el NHP, pero también pueden deberse a factores como la cantidad y calidad del alimento consumido, la mala calidad del agua o del suelo y los cambios ambientales, y también pueden ocurrir en los camarones. -Vibriosis infectada, toxinas envenenadas. o trastornos alimentarios.

Si este fondo mal administrado de un estanque infectado con NHPB no se trata adecuadamente, es probable que se produzca una hepatopancreatitis necrotizante en el próximo ciclo de producción.

Es importante señalar que, en lugar de NHP, los factores ambientales o de gestión de estanques pueden jugar un papel importante en los resultados, ya que la puntuación de lípidos de los animales no infectados también fue baja. En la mayoría de los estanques afectados por la enfermedad, es poco probable que la enfermedad sea causada por una sola etiología. Un caso común es encontrar más de una sustancia que afecte a un animal oa una parte significativa de la población.

Además, la presencia de una serie de factores o factores etiológicos puede dar lugar a diagnósticos inexactos, ya que las infecciones virales suelen ir acompañadas de infecciones bacterianas secundarias que pueden provocar la muerte de animales previamente atenuados por el virus.

Al igual que en los ensayos en húmedo, ninguna de las lesiones histopatológicas fue específica de NHP, ya que las lesiones pueden estar asociadas con otras enfermedades o toxinas. Por esta razón, la PCR es un método importante para el diagnóstico de NHP, ya que permite la detección de bacterias no cultivadas incluso cuando se debe analizar una gran cantidad de muestras simultáneamente.

Un resultado positivo de la PCR no siempre significa que el patógeno está causando la enfermedad. A veces, un huésped puede coexistir con un patógeno que tiene pocos o ningún efecto adverso sobre la salud del huésped y la virulencia, concentración y capacidad del patógeno para comprometer la protección inmunológica del huésped.

(Nota del editor: este artículo se publicó originalmente en la edición de noviembre / diciembre de 2011 de ).

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