Detección de bacterias productoras de histamina en peces

La intoxicación por escombrotoxina es responsable de una gran proporción de las enfermedades relacionadas con los productos del mar en EE. UU.

El pescado fresco no contiene histamina, pero las bacterias en mal estado pueden formar este compuesto y hacer que los mariscos no sean seguros para comer.

La histamina y otras aminas biogénicas están presentes en muchas cantidades en muchos alimentos. El pescado fresco prácticamente no contiene histamina en el momento de la cosecha, pero las condiciones posteriores a la cosecha que permiten que las bacterias de descomposición se multipliquen pueden provocar la formación de histamina.

Intoxicación por pescado con histamina

La intoxicación de peces por histamina (o escombrotoxina) ocurre en todo el mundo a través de la ingestión de cantidades peligrosas de pescado que contienen histamina y otras aminas biogénicas como la putrescina y la cadaverina. En los Estados Unidos, esta intoxicación representó el 7.5 por ciento de todos los brotes transmitidos por alimentos y el 38 por ciento de todas las enfermedades relacionadas con los mariscos reportadas entre 1990 y 2003. Entre 1998 y 2007, se notificaron a 321 Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.

La enfermedad humana se desarrolla rápidamente después de la ingestión de pescado con niveles elevados de histamina y dura desde varios minutos hasta algunas horas. Los síntomas incluyen reacciones de tipo alérgico como dolor de cabeza, mareos, hinchazón de la lengua, náuseas, vómitos, diarrea y dolor abdominal. La intoxicación por pescado con histamina suele ser evidente y la recuperación es completa.

La histamina es producida por ciertos organismos descompuestos por la enzima histidina descarboxilasa (HDC), que convierte el aminoácido histidina en histamina. Hay dos clases de enzimas HDC. Se ha encontrado una clase en células eucariotas y bacterias gramnegativas. El segundo grupo se encuentra en bacterias grampositivas.

Ambos grupos tienen diferentes coenzimas asociadas a ellos. Las bacterias gram-positivas productoras de histamina se asocian más comúnmente con productos fermentados como salami, queso, chucrut y vino, mientras que las bacterias gram-negativas productoras de histamina se asocian más comúnmente con el pescado. Muchas bacterias gramnegativas pueden producir histamina en el pescado, pero los tipos principales son las bacterias mesófilas entéricas y marinas.

La Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos considera que el pescado con más de 50 ppm de histamina se descompone y el pescado que contiene más de 500 ppm de histamina es peligroso para la salud humana. Por lo tanto, las bacterias que producen un alto nivel de histamina representan un mayor riesgo para la salud humana que los productores que producen un bajo nivel de histamina.

Análisis

Los métodos para el análisis de la histamina de pescado incluyen ensayos de inmunoensayos cualitativos y cuantitativos, así como métodos de cromatografía líquida de alta resolución. Para desarrollar estrategias de mitigación efectivas, es necesario comprender mejor los vínculos entre la presencia de bacterias productoras de histamina y la formación de histamina en los peces.

El análisis rápido de las bacterias productoras de histamina puede ayudar a identificar las condiciones que causan la producción de histamina y la intoxicación por histamina en los peces. Por tanto, se necesitan métodos fiables, rápidos y precisos para la detección de bacterias productoras de histamina en peces.

Métodos de detección tradicionales

Las bacterias productoras de histamina se detectan tradicionalmente mediante métodos de cultivo diferencial utilizando agar o caldo (Tabla 1). Aunque estos métodos son fáciles de usar y económicos, tienen varios inconvenientes. Por ejemplo, el pH bajo (5.3) del medio puede inhibir el crecimiento de algunas bacterias productoras de histamina. Y algunas cepas bacterianas, por ejemplo Fotobacteria damselae y Hafnia alvei, no crece bien a pH bajo. Sin embargo, elevar el pH puede aumentar el riesgo de reacciones positivas falsas.

Butler, Comparación de métodos de detección, Tabla 1

MétodoFalso positivoDirecciónResultadosTiempo

Agar diferencial 15-75% HPB alto y bajo Cualitativo 2 días
Caldo diferencial HPB alto y bajo Cualitativo cuantitativo 2 días
Hibridación de elevación de colonias 0 Alto HPB Cuantitativo 2 días
PCR tradicional 0 Alto HPB Cualitativo 1-2 días
PCR en tiempo real 0 Alto HPB Cuantitativo 1 hora

Tabla 1. Comparación de métodos de detección de bacterias productoras de histamina (HPB).

Varios autores han informado de resultados falsos positivos del 15 al 72 por ciento debido a otros procesos metabólicos bacterianos que elevan el pH del medio y conducen a un cambio de color similar al de la producción de histamina. Por estas razones, los métodos basados ​​en cultivos diferenciales se consideran los más adecuados para detectar la presencia de bacterias productoras de histamina en peces, seguidos de la confirmación de la producción de histamina por métodos químicos.

El segundo método de detección utiliza análisis físico-químico. Se puede utilizar un método potenciométrico que detecta bacterias productoras de histamina en peces midiendo el aumento de conductividad en un medio de cultivo para detectar cepas bacterianas. Es muy eficaz para detectar bacterias con alta producción de histamina, pero no es adecuado para detectar bajas producciones de histamina.

Técnicas moleculares

El método de prueba de hibridación de colonia utiliza histamina
producir bacterias en el pescado.

La investigación reciente se ha centrado en el desarrollo de métodos moleculares dirigidos al gen de la EH de bacterias gramnegativas productoras de histamina. Varios investigadores han utilizado métodos de amplificación de ácidos nucleicos dirigidos a diferentes fragmentos del gen HDC. Método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica la región variable del gen del rDNA 16S de un productor con alto contenido de histamina (Morganella morganii) fue desarrollado para detectarlo. Dichos métodos pueden usarse para confirmar cultivos bacterianos que se criban positivamente en el medio de Niven, pero no descartan la necesidad de controlar la producción de histamina mediante análisis químico.

Aunque los métodos moleculares dan menos resultados positivos falsos que los métodos basados ​​en cultivos, parecen detectar solo bacterias con alta producción de histamina. Los autores compararon los métodos de PCR tradicionales, potenciométricos y basados ​​en cultivos para la detección de bacterias productoras de histamina y encontraron que, aunque el método de Niven detectaba cepas de alta y baja producción de histamina, daba un gran número (38 por ciento) de falsos positivos. resultados. Los métodos potenciométricos y basados ​​en PCR no dieron resultados falsos positivos para las cepas con alta producción de histamina, pero no identificaron productores bajos de histamina.

Puede haber varias explicaciones para la falta de detección de bacterias con baja producción de histamina por métodos moleculares. Primero, aún no se conoce el gen específico de los productores bajos de histamina. Es posible que estas bacterias no porten el gen HDC y produzcan histamina de alguna otra manera. De hecho, además de los sustratos naturales, se sabe que la histidina es descarboxilada por otros aminoácidos descarboxilasas.

En segundo lugar, el gen HDC de estas bacterias puede estar ligado a un plásmido y no puede detectarse mediante métodos moleculares. También puede desaparecer durante el subcultivo de las cepas.

Cultivo combinado, técnicas moleculares

Para superar algunas de las limitaciones de la técnica molecular, los autores combinaron métodos basados ​​en cultivos con hibridación de ácidos nucleicos.

La hibridación de aumento de colonias es una técnica que se adapta de forma única a situaciones en las que el rendimiento de los medios selectivos o diferenciales es menos que perfecto, ya que proporciona resultados cuantitativos más precisos porque el organismo objetivo puede confirmarse sin la necesidad de subcultivo. Por lo tanto, los autores desarrollaron sondas marcadas con digoxigenina para la detección y cuantificación de bacterias productoras de histamina mediante hibridación de colonias. Este nuevo método se dirige a cepas bacterianas con alta producción de histamina en función de la especificidad de las sondas que se dirigen al gen HDC de estos organismos.

Una mezcla de sondas generada por amplificación por PCR y marcaje de los genes HDC de cuatro cepas de alta producción de histamina (M. morgannii, R. planticola, E. aerogenes y P. damselae) funcionó extremadamente bien cuando se administró a cepas que producían más de 1000 ppm de histamina. El estudio mostró una especificidad del 100% para las cepas con alta producción de histamina utilizando una mezcla de sonda para una colección de cultivo de 152 bacterias gramnegativas de histamina y no productoras de histamina.

El método no identificó ni diferenciaba entre bacterias bajas y libres de histamina. Sin embargo, el estudio proporcionó evidencia de que la hibridación de mejora de colonias puede usarse para detectar y cuantificar bacterias con alta producción de histamina.

Recientemente, investigadores de la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. Desarrollaron un método de PCR en tiempo real para detectar bacterias productoras de histamina. La PCR en tiempo real requiere mucho menos tiempo que la PCR tradicional, cuyos resultados generalmente se obtienen en una hora. Además de la amplificación del molde, se puede añadir al ensayo una molécula de ácido nucleico de control interno para evitar resultados falsos negativos.

Perspectivas

El desarrollo de métodos fiables, rápidos y precisos para la detección de bacterias productoras de histamina en peces sigue siendo un objetivo de investigación. Se han tomado pasos importantes para desarrollar métodos moleculares más rápidos y confiables, pero se necesita más investigación para identificar bacterias con baja producción de histamina.

El análisis rápido de las bacterias productoras de histamina puede ser una herramienta útil para identificar las condiciones que causan la producción de histamina y el envenenamiento de los peces. A medida que se han desarrollado métodos de detección más completos, se pueden validar frente a organismos productores de histamina conocidos para determinar el riesgo de intoxicación por histamina en los peces.

(Nota del editor: este artículo se publicó originalmente en la edición de septiembre / octubre de 2010 de ).

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